Né le 6 février 1932 de père inconnu et reconnu à l'état civil par Roland Truffaut, architecte-décorateur, il ne retrouvera son père biologique, un dentiste juif de Belfort (Roland Lévy), qu'en 1968. Sa mère était Jeanine de Monferrand, secrétaire au journal L'Illustration. François Truffaut fait ses études à l'école de la rue Clauzel et au lycée Rollin (actuellement lycée Jacques-Decour), théâtre de ses premiers « 400 coups ». Dès 1939, le jeune François Truffaut, passionné de lecture, fréquente aussi les cinémas, souvent pendant les heures de classe. À partir de 1946, ayant quitté l'école, il vit de petits boulots, il fonde un ciné-club en 1947, quelques vols lui valent d'être envoyé à Villejuif dans une « maison de redressement ». Il a plus ou moins transposé cet épisode de sa vie dans Les Quatre Cents Coups et son personnage d'adolescent dans celui d'Antoine Doinel. Ce n'est d'ailleurs pas un hasard si Doinel « sèche » son cours de gym pour lire La Recherche de l'absolu. Truffaut était lui-même grand lecteur de Balzac, dans sa jeunesse. Il le montre ouvertement en faisant ressurgir Balzac dans un autre film, Baisers volés. Antoine Doinel (Truffaut ?), y vit littéralement l'intrigue du Lys dans la vallée. Mais Fabienne Tabard, en qui il voit l'héroïne du roman, le rappelle à la réalité : « Moi aussi, dit-elle, j'ai lu Le Lys dans la vallée, mais je ne suis pas Madame de Mortsauf et vous n'êtes pas Félix de Vandenesse. »

Grâce au critique de cinéma André Bazin, François Truffaut est engagé à Travail et Culture. Il rédige ses premiers articles dès 1950. Après s'être engagé dans l'armée, envoyé en Allemagne, il déserte et fait de la prison militaire, puis se fait réformer, toujours grâce à André Bazin. François Truffaut publie des articles pour les Cahiers du cinéma en 1953, réalise l'année suivante Une visite son premier court métrage, devient en 1956 assistant du réalisateur Roberto Rossellini. Il réalise Les Mistons en 1957. Cet « homme qui aimait les femmes » se marie cette même année avec Madeleine Morgenstern, fille d'un distributeur de films, (Ignace Morgenstern) avec laquelle il a deux filles prénommées Laura et Éva. Il divorce en 1964. En 1959, il tourne Les Quatre Cents Coups, qui devient un succès immédiat, ouvrant la porte au mouvement de la Nouvelle Vague et à sa carrière mondiale. En 1968, Truffaut veut se marier avec son actrice préférée, Claude Jade (Baisers volés, Domicile conjugal, L'Amour en fuite), mais revient sur sa décision au dernier moment. Truffaut et Claude Jade restent cependant d'excellents amis.

Il enchaîne ensuite les films jusqu'à sa mort survenue le 21 octobre 1984 à l'Hôpital américain de Paris de Neuilly-sur-Seine des suites d'une tumeur au cerveau. Il a été incinéré au cimetière du Père Lachaise ; ses cendres ont été inhumées au cimetière de Montmartre à Paris.

Son dernier amour fut l'actrice Fanny Ardant (Vivement dimanche !, La femme d'à côté), avec laquelle il a eu une fille, Joséphine, née le 28 septembre 1983.

François Truffaut apparaît comme acteur de plusieurs de ses films : La Chambre verte (1978), La Nuit américaine (1973), L'Enfant sauvage (1970), il apparaît également dans L'Histoire d'Adèle H. (1975), furtivement au début de L'Homme qui aimait les femmes (1977), ainsi que dans le film de Steven Spielberg, admirateur de Truffaut, Rencontres du troisième type en 1977 dans le rôle du savant français « Claude Lacombe ». Pourtant François Truffaut ne s'est jamais considéré comme un « vrai » acteur.

Sa société de production s'appelait Les Films du Carrosse, en référence au film de Jean Renoir Le Carrosse d'or.