Commençant sur un panneau disant « This film should be played loud! » (« Ce film doit être écouté fort ! »), en référence à la pochette intérieure de l'album Let It Bleed des Rolling Stones, le documentaire étudie les influences du Band et sa carrière. Le groupe, composé de Rick Danko (guitare basse, violon, chant), Levon Helm (batterie, mandoline, chant), Garth Hudson (claviers, saxophone), Richard Manuel (claviers, percussions, chant), et le compositeur Robbie Robertson à la guitare, débuta sa carrière à la fin des années 1950, sous la forme d'un groupe de rock and roll mené par Ronnie Hawkins, le premier invité du concert. Le Band joua pour Bob Dylan dans les années 1960, et Dylan joue avec eux vers la fin du concert.

De nombreux autres artistes jouent avec le Band : Muddy Waters, Paul Butterfield, Neil Young, Joni Mitchell, Van Morrison, Dr. John, Neil Diamond et Eric Clapton, jouant du blues, du rock and roll, du rythm and blues, de la pop, du folk et du rock. D'autres genres apparaissent dans les séquences filmées ultérieurement en studio, avec Emmylou Harris (country) et The Staple Singers (soul et gospel).

Le film s'ouvre sur le Band interprétant en rappel la dernière chanson de la soirée, une reprise du tube de Marvin Gaye Baby Don't You Do It. L'on revient ensuite au début du concert, et la suite est plus ou moins chronologique. Aidé d'une section cuivre, le groupe interprète bon nombre de ses grands succès, dont Up on Cripple Creek, Stagefright et The Night They Drove Old Dixie Down.

Entre les extraits du concert sont intercalées des séquences en studio et des entrevues menées par le réalisateur Martin Scorcese, durant lesquelles les membres du Band reviennent sur l'histoire du groupe. Robertson évoque l'entrée de Hudson dans le groupe, qui se fit à la condition que les autres membres le paient dix dollars par semaine pour des leçons de musique. Hudson, qui avait reçu une formation classique, pouvait donc dire à la ronde qu'il était professeur de musique, non pas un simple musicien de rock. Robertson décrit également l'expérience surréaliste d'avoir joué dans un night-club appartenant à Jack Ruby, l'assassin de l'assassin présumé du président Kennedy.

Manuel se rappelle que parmi les premiers noms du Band, on compta « the Honkies » et « the Crackers » (les deux sont des termes argotiques pour désigner les blancs, utilisés par les noirs américains). Comme Dylan et leurs amis et voisins de Woodstock les appelaient simplement « the band » (« le groupe »), ils décidèrent de s'appeler ainsi. On y voit aussi Danko faire visiter à Scorcese le studio du groupe, appelé Shangri-La, et lui jouer un enregistrement de Sip the Wine, une chanson de son futur album solo Rick Danko, sorti en 1977.

Un thème qui revient régulièrement dans les interviews de Robertson est que le concert marque la fin d'une ère pour le Band ; qu'après seize années passées sur la route, il est temps de passer à autre chose. « C'est ce qu'est La Dernière Valse : seize ans de route. Le chiffre commence à devenir effrayant », déclare Robertson à Scorcese. « Je veux dire, je ne pourrais pas supporter d'avoir derrière moi vingt ans de tournées. Je ne crois pas que je pourrais même en parler ». Ce sentiment est encore accentué par le choix des chansons filmées : par exemple, les paroles d'Up the Cripple Creek qui contient la phrase « this living on the road is getting pretty old » (« cette vie d'itinérant commence à se faire longue »).