Il a joué dans de nombreuses séries comme Buffy contre les vampires, Miss Match ou encore Firefly, série dans laquelle il tenait le rôle principal. En 2009, il a également prêté sa voix au sergent Eddie Buck dans le jeu vidéo Halo 3: ODST. Il est actuellement le héros de la série Castle, où il y interprète le rôle de Richard (Rick) Castle, aux côtés de Stana Katic (Kate Beckett)
1996 : Spin City : Guy (non crédité) (épisode 1.6)
1997 : Total Security : Troy Larson (épisode 8)
1998 : Maggie Winters : Ronald (épisode 1.4)
1998 : Un toit pour trois : Johnny Donnelly
1998 : Il faut sauver le soldat Ryan : Soldat James Frederick Ryan
1999 : Première sortie : Cliff
1999 : Au-delà du réel : l'aventure continue (The Outer Limits) : Michael Ryan (épisode 5.21)
2000 : King of the Hill : Frisbee Guy (voix) (épisode 5.15)
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“ Une fois qu'on a eu sa dose "salutaire" de Nathan Fillion (RIP Firefly), une série d'enquêtes classique à rallonges, rien d'autre. ”— Bornwell15 août 2015
“ Malgré des effets un peu cheap le film fonctionne très bien. Nathan Fillion est très bon dans un rôle proche du bon vieux Han Solo. ”— JohnMurdoch30 décembre 2013
“ Y a un truc de mélomane hippie qui me plait dans "Gardiens de la galaxie", avec sa croyance qu'un arbre et de la musique peuvent tout faire ”— ChrisBeney22 juillet 2014